Clarificación y purificación integradas en un solo paso de un anticuerpo monoclonal utilizando perlas de proteína A Mag Sepharose y un separador magnético de alto gradiente que cumple con las cGMP.

Los anticuerpos monoclonales son un elemento dominante del mercado biofarmacéutico actual y suelen purificarse mediante procesos de plataforma clásicos. Sin embargo, los precios excesivos y el aumento de la demanda son factores que impulsan la aparición de procesos de purificación incorporados más recientes, respetuosos con el medio ambiente y versátiles.

Por el momento, la separación magnética de alto gradiente como dispositivo de captura directa para la purificación de proteínas se ve afectada por la escasez de equipos de separación adecuados que cumplan con las GMP para la escala industrial.

Como respuesta a este cuello de botella, presentamos un proceso de purificación de un anticuerpo monoclonal a partir de una tradición celular CHO mediante el uso de partículas magnéticas funcionalizadas con proteína A junto con el primer separador magnético de alto gradiente a escala piloto que cumple con las GMP.

Se han llevado a cabo 5 ciclos de purificación consecutivos, alcanzando rendimientos constantes superiores al 85% y purezas superiores al 95%. Las viabilidades celulares seguras en el curso de la separación magnética permiten la integración del sistema como dispositivo de eliminación de productos in situ.

Una comparación con los procesos de purificación basados en columnas de proteína A de última generación revela un curso de productividad 3 veces mayor por mL de resina utilizada y demuestra el buen potencial de la separación magnética en el procesamiento posterior.
La fuerza de voluntad de los iones metálicos de pista a través de la separación en línea y la preconcentración mediante el uso de perlas de Sepharose quelantes en un sistema de inyección secuencial de laboratorio en válvula (SI-LOV) acoplado a la detección espectrométrica de absorción atómica electrotérmica.
Se describe y menciona la eficacia analítica de un sistema de laboratorio en válvula de inyección secuencial en línea (SI-LOV) que utiliza perlas de sefarosa quelantes como materiales sorbentes para la fuerza de voluntad de rangos ultratraza de Cd(II), Pb(II) y Ni(II) mediante espectrometría de absorción atómica electrotérmica (ETAAS).

Las muestras se ajustan al pH 5.Cero en línea dentro del sistema para un funcionamiento óptimo. Los iones objetivo se adsorben por quelación en el suelo de las perlas, contenidas en una microcolumna de 20mul a lo largo de la LOV, y tras la elución por 50mul de ácido nítrico 2M, el eluato es, como intercalado por segmentos de aire, lanzado al ETAAS.

Basándose principalmente en el consumo de 1,8ml de resolución del patrón, se han obtenido eficiencias de retención del 95, 75 y 90%, elementos de enriquecimiento de 34, 27 y 32, y límites de potencia de 0,001, 0,07 y 0,02mugl(-1) para Cd(II), Pb(II) y Ni(II), respectivamente.

Las perlas pueden utilizarse repetidamente durante al menos 20 veces sin que disminuya la eficacia, pero pueden cambiarse a voluntad si las circunstancias lo exigen. Los parámetros de procedimiento optimizados confirmaron que se pueden preparar y analizar eficazmente 12 muestras por hora. Los resultados obtenidos para 3 suministros de referencia normales concordaron muy eficazmente con los valores autorizados.
Citotoxicidad de células T CD8(+) murinas frente a la esquistosomia inducida por la inoculación de perlas de Sepharose 4B acopladas a esquistosomas 22.6/26GST.
La esquistosomosis es una enfermedad parasitaria de alcance mundial. Aunque la quimioterapia es el principal método terapéutico para la esquistosomiasis en la actualidad, no puede prevenir la reinfección de esquistosomas.

Hasta el momento no existe ninguna vacuna eficaz para prevenir la esquistosomiasis. Las células dendríticas (DCs) son uno de los jugadores clave dentro de la respuesta inmune móvil y juegan una posición esencial en la presentación de antígenos como células presentadoras de antígenos.

En este trabajo se presenta un nuevo antígeno particulado masivo, en el que las perlas de Sepharose 4B han sido recubiertas con Sj22.6/26GST. Nuestros resultados confirmaron que este antígeno particulado puede ser presentado de forma cruzada por las DCs a las células T CD8(+).

Además, las células T CD8(+) estimuladas por el antígeno particulado ejercieron instantáneamente citotoxicidad frente a Schistosoma japonicum schistosomula. Además, demostramos que S. japonicum schistosomula adquiría las moléculas MHC de clase I del suero sanguíneo del huésped y las ofrecía en el suelo de las larvas.

Mientras que esto podría ayudarles a escapar de la vigilancia inmunológica del huésped, estos complejos de antígenos MHC I ofrecidos en el suelo convierten a los esquistosómulos en objetivos potenciales de la citotoxicidad de las células T CD8(+) inducida por la vacuna basada en antígenos particulados. Por último, evaluamos la inmunidad protectora de esta vacuna de partículas en un maniquí de ratón con problemas de infección.

Nuestros conocimientos confirmaron claramente que la vacuna en partículas indujo una reducción parcial de la carga de gusanos y de los cientos de huevos. En conjunto, estos resultados aconsejan que esta vacuna masiva en partículas puede ser una posible vacuna para la prevención de la infección por esquistosoma.
Inmunoensayos de puntos cuánticos en columna de suelo renovable y en placa de 96 pocillos para la detección por fluorescencia de la neurotoxina botulínica utilizando anticuerpos de alta afinidad.
Se ha desarrollado un inmunoensayo de fluorescencia en sándwich que utiliza anticuerpos de alta afinidad y reporteros de puntos cuánticos (QD) para la detección de la neurotoxina botulínica

Los anticuerpos utilizados, AR4 y RAZ1, se unen a epítopos no superpuestos presentes en la toxina total y en el fragmento recombinante. En un formato único, el inmunoensayo se lleva a cabo en una placa de 96 pocillos con detección en un lector de placas normal utilizando AR4 como anticuerpo incautador y RAZ1 acoplado a QD como reportero.

Se demostró la detección hasta 31 pM con un tiempo de incubación completo de tres horas. En un segundo formato, el anticuerpo de incautación AR4 se acopló a perlas de Sepharose, y las reacciones se llevaron a cabo en tubos de microcentrífuga con un tiempo de incubación de 1 hora.

Posteriormente, las perlas se han capturado y concentrado en una célula de circulación de “suelo renovable” de varilla giratoria equipada con un sistema de fibra óptica para realizar mediciones de fluorescencia. En tampón PBS, el fragmento de BoNT/A-H(C) se detectó hasta concentraciones de tan sólo 5 pM utilizando la estrategia de medición fluídica.

Los espermatozoides de ratón capacitados e intactos en el acrosoma se unen a las perlas de Sepharose recubiertas con neoglicoproteínas intencionadas.

Los espermatozoides de ratón capacitados e intactos en el acrosoma se unen a la capa extracelular del óvulo, la zona pelúcida (ZP), en un método receptor-ligando mediado por carbohidratos. La unión estrecha e irreversible de los gametos alternativos desencadena una vía de transducción de señales que se traduce en la exocitosis del contenido acrosomal (es decir, la inducción de la respuesta acrosomal AR).

Anteriormente, demostramos que una hexosa (manosa) y dos aminoazúcares (N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina), cuando se conjugaban covalentemente con la albúmina de suero bovino (BSA) (neoglucoproteínas intencionales, ngps), imitaban a la mZP3 e inducían la respuesta acrosómica Biol. Reprod. 60 (1999) 94-101.

Para dilucidar la especificidad de la interacción espermatozoide-ngp y la posición de mZP3 de las ngps intencionales, hemos examinado la unión de los espermatozoides de ratón a las perlas de Sepharose 4B recubiertas con las ngps intencionales y no funcionales además de BSA, ovalbumina (OVA), o asialofetuina (ASF).

Una variedad considerablemente mayor de espermatozoides capacitados e intactos en el acrosoma se adhirió a las perlas recubiertas con ngps funcionales que a las perlas recubiertas con ngps no funcionales, BSA, OVA o ASF. La unión fue sensible a la temperatura y fue más alta cuando el ensayo de perlas de esperma se llevó a cabo a 37 niveles C.

El bloqueo de la capacitación in vitro, junto con antagonistas de la calmodulina en el medio de incubación, impidió que los espermatozoides se unieran a las microesferas. Además, la inclusión de azúcares libres (manosa, N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) en el ensayo de unión, tanto de forma individual como combinada, inhibió la unión de los espermatozoides a las perlas en un método dependiente de la concentración.

En conjunto, nuestros conocimientos presentan pruebas que sugieren fuertemente que la unión de los espermatozoides capacitados a las perlas de sefarosa recubiertas de ngp es particular. Las perlas que imitan a los óvulos intactos de la zona presentan un dispositivo magnífico para analizar los resultados farmacológicos de los reactivos que alteran el funcionamiento de los espermatozoides.

Además, la(s) ngp(s) inmovilizada(s) probablemente será(n) útil(es) como medio de afinidad para aislar el(los) receptor(es) del suelo de los espermatozoides que reconocen y se unen a los residuos de azúcar.

Fuente :
1. NCBI
2. Gentaur